猪O3FAR1基因启动子的克隆及转录调控分析

【摘要】因为在遗传以及理化因素等方面与人存在很大的相似性,猪,这一主要家畜,常常作为模型被用于一些疾病的研究,比如说糖尿病和肥胖,脂代谢紊乱等。近年来,游离脂肪酸的生理功能受到广泛关注,因为其不仅可以为组织提供能量而且还可以作为信号分子介导各种细胞进程。有研究发现,糖尿病、肥胖、脂代谢紊乱与外周游离脂肪酸水平的升高存在着紧密的联系。03FAR1是新发现的的长链脂肪酸受体,体内的脂质生成、细胞增殖、激素分泌等代谢过程都存在着03FAR1的参与。03FAR1被认为与某些疾病有关,可以把它当作一些疾病的药物靶点,比如说肥胖症,糖尿病等。在基因表达调控机制中,基因的转录是一个非常主要的过程,它在遗传信息传递中起到着纽带的作用。而转录的频率和转录起始位点受到启动子这一关键的元件调控。启动子主要通过与转录因子相互作用,来调控基因的表达。启动子的识别,对于阐述基因的功能来说有着非常重要的作用。为了进一步了解猪03FAR1基因的功能和转录调控机制,我们克隆出猪03FAR1基因的启动子区域,并对其核心区域进行研究,研究结果如下：(1)利用荧光定量PCR技术检测了猪的O3FAR1基因在各个组织的表达情况,并绘制了组织表达谱。从结果来看,猪03FAR1基因的表达比较广泛,在不同组织中表达量不同。在小肠中表达量很高,但是在脂肪组织中,表达量明显高于其他组织。(2)从NCBI获取03FAR1基因5’端上游调控序列,以此为模板,我们克隆了猪03FAR1基因5’端上游调控序列2003bp。利用PromoterScan、Promoter2.0、TFsearch等在线工具分析预测该基因的5’端上游调控序列,发现存在很多转录因子结合位点,比如sp1,C/EBP,GATA-1等。与此同时,还发现了两个CpG岛。(3)通过对不同物种03FAR1基因的比对可以发现,03FAR1基因是一个比较保守的基因。在鼠、人、狗、猪等动物中存在较高的保守性。猪和鼠、人、狗的相似度分别为86.98%、82.23%、89.47%。(4)利用PGL3-BASIC双荧光素酶报告基因载体构建了7个缺失片段,并将其转染至3种细胞中,检测荧光活性。发现缺失片段PGL3-P7具有较高的活性,推测核心启动子区可能位于-298bp/+78bp的范围内。(5)通过对PGL3-P7的分析发现,在此区域内存在转录因子C/EBPβ的结合位点。通过点突变试验分别构建野生型和突变型质粒,结果发现突变的质粒载体荧光活性确实显著降低。(6)超表达转录因子C/EBPp后,利用RT-PCR检测03FAR1基因的mRNA水平,发现mRNA水平上升极显著(P<0.01)；利用siRNA技术干扰细胞内源性C/EBPβ后,发现03FARl基因的mRNA水平显著下降(P<0.05)。(7)根据预测的转录因子结合序列设计探针,利用EMSA技术从蛋白水平证实转录因子C/EBPp确实与O3FAR1基因启动子结合。(8)利用真核表达载体pcDNA3.1与获得的03FAR1基因CDS区,构建了猪03FAR1基因的pcDNA3.1-CDS真核表达载体,转染细胞进行超表达试验,RT-PCR分析发现03FAR1基因mRNA水平上升极为显著(P<0.01)。
【作者】周计丹；
【导师】熊远著；
【作者基本信息】华中农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】猪；O3FAR1基因；启动子；转录因子；EMSA；

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